蛋白類生物制品中常見的表面活性劑
時間：2023-08-14 10:16:00 來源：創始人
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聚山梨（醇）酯20/80是生物制品(pin)(pin)中常見(jian)的(de)非離(li)子(zi)型表(biao)面活性(xing)(xing)劑，常見(jian)于蛋白(bai)(bai)類產品(pin)(pin)的(de)輔(fu)料添加中。相比于離(li)子(zi)表(biao)面活性(xing)(xing)劑（如十(shi)二(er)烷基(ji)硫酸鈉），非離(li)子(zi)型表(biao)面活性(xing)(xing)劑避(bi)免了與帶電蛋白(bai)(bai)質分子(zi)發生的(de)強(qiang)相互作(zuo)用，而且(qie)毒性(xing)(xing)低且(qie)臨(lin)床耐(nai)受性(xing)(xing)好(hao)。
FDA已經批準(zhun)上市的(de)(de)(de)近120款抗體(ti)類(lei)產(chan)(chan)品(pin)（單抗、雙抗和ADC），產(chan)(chan)品(pin)中的(de)(de)(de)表面活性(xing)劑添(tian)加(jia)不低于產(chan)(chan)品(pin)總數的(de)(de)(de)70%，聚(ju)(ju)山(shan)(shan)梨(li)(li)酯(zhi)20和聚(ju)(ju)山(shan)(shan)梨(li)(li)酯(zhi)80的(de)(de)(de)添(tian)加(jia)又分(fen)別占(zhan)到了其中的(de)(de)(de)30%和70%左右，還有少量產(chan)(chan)品(pin)中添(tian)加(jia)了波洛沙姆(mu)188。聚(ju)(ju)山(shan)(shan)梨(li)(li)酯(zhi)80是1986年(nian)第一(yi)個上市單克隆抗體(ti)產(chan)(chan)品(pin)（Orthoclone OKT3，1986）輔(fu)料(liao)之(zhi)一(yi)，聚(ju)(ju)山(shan)(shan)梨(li)(li)酯(zhi)類(lei)表面活性(xing)劑的(de)(de)(de)常見使用濃度在(zai)0.01 mg/mL到1.0 mg/mL之(zhi)間。表(biao)1：表(biao)面(mian)活性劑(ji)常見用(yong)量示例
一般(ban)認為表面活性劑的(de)(de)添加具有1）表面活性劑與(yu)蛋(dan)白類(lei)產(chan)品競爭氣-液的(de)(de)交(jiao)界面，從而減低(di)蛋(dan)白產(chan)品的(de)(de)暴露(lu)；2）降低(di)產(chan)品與(yu)其接觸(chu)面（如(ru)管(guan)壁、瓶塞等）的(de)(de)非特異(yi)性吸附；3）增加產(chan)品的(de)(de)溶解(jie)度(du)。
圖(tu)1：蛋(dan)白(bai)質穩定的不同機(ji)制示意圖(tu)聚(ju)山(shan)(shan)梨(li)酯(zhi)其實(shi)是一種(zhong)(zhong)混合(he)物(wu)，主(zhu)要為聚(ju)氧(yang)(yang)乙(yi)(yi)烯山(shan)(shan)梨(li)醇(chun)(chun)(chun)(chun)脂肪(fang)酸酯(zhi)組(zu)成(cheng)(cheng)的一種(zhong)(zhong)兩親性非離子表面活(huo)性劑。下圖(tu)為聚(ju)山(shan)(shan)梨(li)酯(zhi)80的合(he)成(cheng)(cheng)過程示(shi)例(li)。山(shan)(shan)梨(li)醇(chun)(chun)(chun)(chun)首先脫(tuo)水(shui)成(cheng)(cheng)脫(tuo)水(shui)山(shan)(shan)梨(li)醇(chun)(chun)(chun)(chun)（脫(tuo)水(shui)山(shan)(shan)梨(li)醇(chun)(chun)(chun)(chun)可以進一步脫(tuo)水(shui)成(cheng)(cheng)異山(shan)(shan)梨(li)醇(chun)(chun)(chun)(chun)），脫(tuo)水(shui)產(chan)(chan)物(wu)與環氧(yang)(yang)乙(yi)(yi)烷反(fan)應并進一步與油酸（或(huo)月桂酸）部分酯(zhi)化，分別生成(cheng)(cheng)聚(ju)山(shan)(shan)梨(li)酯(zhi)80（或(huo)聚(ju)山(shan)(shan)梨(li)酯(zhi)20），產(chan)(chan)物(wu)中通常存在許多未酯(zhi)化的分子（圖(tu)2）。
圖2：聚山(shan)梨酯(zhi)80的合(he)成。使用月桂酸(suan)代替油酸(suan)，以類似的方(fang)式合(he)成聚山(shan)梨醇酯(zhi)20。聚山(shan)(shan)梨(li)醇酯(zhi)是由不(bu)同(tong)(tong)脂肪酸酯(zhi)組成的多相(xiang)混合物，中國(guo)藥典要求(qiu)聚山(shan)(shan)梨(li)酯(zhi)80和聚山(shan)(shan)梨(li)酯(zhi)20中的油酸含量范(fan)圍分別為(wei)不(bu)低于58.0%，月桂酸應為(wei)40.0%～60.0%之間。一份(fen)數據顯示，不(bu)同(tong)(tong)供應商(shang)間不(bu)同(tong)(tong)批次（A1-E3）聚山(shan)(shan)梨(li)酯(zhi)80均有(you)差異（表2）。表2：不同供應商間不同批次聚山梨酯80（PS80）差異(yi)（紅(hong)框(kuang)標(biao)注）
研發生產(chan)(chan)過(guo)程中(zhong)應考慮(lv)到(dao)產(chan)(chan)品(pin)(pin)輔料(liao)本身對產(chan)(chan)品(pin)(pin)的的影響，以確保(bao)最(zui)終產(chan)(chan)品(pin)(pin)的安全有效性(xing)，各(ge)國藥典要求市售產(chan)(chan)品(pin)(pin)必須滿足其(qi)最(zui)低(di)標準才可允許其(qi)銷售（表(biao)(biao)3）。表(biao)(biao)1表(biao)(biao)明(ming)產(chan)(chan)品(pin)(pin)中(zhong)聚(ju)山(shan)梨酯的實際(ji)(ji)使用(yong)量(liang)較低(di)，實際(ji)(ji)采購時應該(gai)考慮(lv)到(dao)訂購量(liang)的問(wen)題以防(fang)發生輔料(liao)變質問(wen)題。表3：國際藥典(dian)描述了(le)用于制藥目的的市售產品必須滿足(zu)的最低標準
除(chu)聚(ju)山梨酯(zhi)(zhi)(zhi)原料之(zhi)外，聚(ju)山梨酯(zhi)(zhi)(zhi)本身也存在著降(jiang)解(jie)風(feng)險而造成其(qi)中含有的(de)(de)(de)物質(zhi)更加(jia)復雜。通常而言，聚(ju)山梨酯(zhi)(zhi)(zhi)有酸(suan)/堿/酶催(cui)化的(de)(de)(de)水解(jie)風(feng)險以及(ji)包括金屬(shu)離(li)子在內(nei)造成的(de)(de)(de)氧化降(jiang)解(jie)風(feng)險，聚(ju)山梨酯(zhi)(zhi)(zhi)暴露于(yu)空氣、光和過渡金屬(shu)是導(dao)致(zhi)其(qi)氧化的(de)(de)(de)已知因(yin)素，酶介導(dao)的(de)(de)(de)水解(jie)（一(yi)般由宿主蛋白介導(dao)）被認為是在生物藥(yao)中觀(guan)察到(dao)的(de)(de)(de)降(jiang)解(jie)的(de)(de)(de)主要原因(yin)。抗體類產(chan)品使(shi)用的(de)(de)(de)溶媒一(yi)般是生理鹽水或者(zhe)無菌注(zhu)射用水，聚(ju)山梨酯(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)降(jiang)解(jie)產(chan)物中的(de)(de)(de)游離(li)脂肪酸(suan)溶解(jie)度差，是形成不溶性顆粒的(de)(de)(de)的(de)(de)(de)主要原因(yin)之(zhi)一(yi)。
圖3：聚山梨酯降(jiang)解(jie)的主要途徑針(zhen)(zhen)對水解，實(shi)際(ji)產品(pin)中經(jing)常會添加一(yi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)緩(huan)沖輔料（如(ru)(ru)組氨酸(suan)(suan)（鹽）、磷酸(suan)(suan)鹽等），因此(ci)聚(ju)(ju)山(shan)梨(li)酯所(suo)處(chu)的(de)(de)(de)(de)體系(xi)酸(suan)(suan)堿度變(bian)化應(ying)該不大(da)。宿主蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)留是一(yi)個棘手的(de)(de)(de)(de)問(wen)(wen)題，促使(shi)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)產生(sheng)多種聚(ju)(ju)集體以(yi)至于產生(sheng)肉眼(yan)可(ke)(ke)見(jian)的(de)(de)(de)(de)顆粒，如(ru)(ru)蛋(dan)白(bai)質二硫化物酶(mei)（PD19）、熱(re)休克(ke)蛋(dan)白(bai)（DanK）等參與到(dao)了聚(ju)(ju)集進程(cheng)中，不僅(jin)如(ru)(ru)此(ci)，宿主蛋(dan)白(bai)也會導致制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)降解的(de)(de)(de)(de)發生(sheng)，使(shi)聚(ju)(ju)山(shan)梨(li)酯功能喪失(shi)而(er)破壞制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)穩定(ding)性。針(zhen)(zhen)對宿主蛋(dan)白(bai)殘(can)(can)留，上(shang)游可(ke)(ke)以(yi)通(tong)(tong)過對細(xi)胞系(xi)相關基因的(de)(de)(de)(de)敲減(jian)（在不影響實(shi)際(ji)生(sheng)產條件下(xia)），細(xi)胞培養條件優(you)化，下(xia)游可(ke)(ke)以(yi)通(tong)(tong)過優(you)化純化步驟來(lai)改善，應(ying)該注意到(dao)高濃度抗體產品(pin)可(ke)(ke)能會伴隨高濃度酶(mei)雜(za)質的(de)(de)(de)(de)存(cun)在。當然，過程(cheng)中有可(ke)(ke)能含有具(ju)有酶(mei)活性的(de)(de)(de)(de)其他(ta)物質，根據(ju)其性質，應(ying)該有針(zhen)(zhen)對性的(de)(de)(de)(de)去處(chu)理。針(zhen)(zhen)對金屬離子（一(yi)般為銅(tong)、鐵離子）在內(nei)造成的(de)(de)(de)(de)氧化問(wen)(wen)題，一(yi)般可(ke)(ke)以(yi)通(tong)(tong)過添加依地酸(suan)(suan)二鈉來(lai)改善，而(er)緩(huan)沖劑(ji)(ji)中常見(jian)的(de)(de)(de)(de)檸檬酸(suan)(suan)也可(ke)(ke)以(yi)起到(dao)絡合(he)金屬離子的(de)(de)(de)(de)作用。針對幾種常見的緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)(xi)中（組(zu)氨(an)(an)酸(suan)體(ti)系(xi)(xi)、檸檬酸(suan)體(ti)系(xi)(xi)、琥珀(po)酸(suan)體(ti)系(xi)(xi)和磷酸(suan)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)(xi)），聚(ju)(ju)山(shan)梨(li)酸(suan)酯(zhi)在組(zu)氨(an)(an)酸(suan)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液中的降(jiang)解率最高（圖4）。該實驗的組(zu)氨(an)(an)酸(suan)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)(xi)以及聚(ju)(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)的使(shi)用濃度(du)接近實際(ji)獲批上(shang)市(shi)抗體(ti)類產品的實際(ji)使(shi)用濃度(du)，提供了一定的借(jie)鑒意(yi)義(yi)。在配(pei)方篩(shai)查時，采(cai)用聚(ju)(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)為(wei)(wei)表(biao)面活(huo)性劑的產品中，配(pei)方中緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)劑的選擇應該是(shi)需要考慮的一種因(yin)素(su)。值得注(zhu)意(yi)的是(shi)近120款抗體(ti)類產品中有(you)50%左右的產品中采(cai)用組(zu)氨(an)(an)酸(suan)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)(xi)，而組(zu)氨(an)(an)酸(suan)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)體(ti)系(xi)(xi)中有(you)超過50%產品添(tian)加的表(biao)面活(huo)性劑為(wei)(wei)聚(ju)(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)。
實(shi)際的(de)(de)配方(fang)組成(cheng)要(yao)考慮到多種(zhong)成(cheng)分的(de)(de)添加(jia)以及各種(zhong)成(cheng)分的(de)(de)比例(li)以及實(shi)際的(de)(de)用量，正交實(shi)驗可能是針對這(zhe)樣變(bian)量繁多而復(fu)雜實(shi)驗的(de)(de)良好解決方(fang)法。常見的(de)分(fen)離方法(fa)是(shi)色譜(pu)法(fa)（如HPLC），檢測方法(fa)有紫外/可見光(guang)譜(pu)和(he)(he)熒光(guang)光(guang)譜(pu)、質譜(pu)法(fa)等等。由于(yu)聚山梨(li)酯(zhi)本身(shen)的(de)異質性(xing)以及降解產物的(de)復雜性(xing)，為其定(ding)(ding)性(xing)和(he)(he)定(ding)(ding)量表(biao)征提出了挑戰(zhan)。由于(yu)聚山梨(li)酯(zhi)復雜的(de)組成、異質性(xing)和(he)(he)缺(que)乏(fa)生色團(tuan)，開發和(he)(he)驗(yan)證多山梨(li)酸(suan)酯(zhi)的(de)分(fen)析方法(fa)是(shi)比較困難(nan)的(de)。由于上述聚(ju)山(shan)梨酯可能存在的(de)問題，其(qi)(qi)他(ta)的(de)表(biao)面活(huo)性劑(ji)可能是替(ti)代(dai)其(qi)(qi)作(zuo)用(yong)的(de)良好輔料。FDA批準上市的(de)抗體類中還(huan)有一些產品采用(yong)泊洛沙姆188（P188）替(ti)代(dai)聚(ju)山(shan)梨酯作(zuo)為表(biao)面活(huo)性劑(ji)。實(shi)際上P188 被批準用于各種配(pei)方(fang)中，作為(wei)乳化劑(ji)、增溶(rong)劑(ji)和分(fen)散(san)劑(ji)等。表4：FDA批準上市含泊洛沙姆(mu)抗體輔(fu)料信息
Grapentin C等人研究了四(si)種單抗(kang)在(zai)含有聚山(shan)梨酯或P188不(bu)同(tong)液體配方的(de)玻璃瓶中穩定(ding)性，發現(xian)P188在(zai)脅迫(凍(dong)融、搖動(dong))條(tiao)件下(xia)提供與聚山(shan)梨酯相(xiang)當(dang)的(de)保護效果(guo)（圖5）。
圖5：泊洛沙姆(mu)188和(he)聚山梨酯對蛋白(bai)制劑保護效果聚(ju)山梨酯中的酯鍵存在酶解(jie)或化學水解(jie)問題，而P188的結構對其(qi)則有(you)良好的規避。但(dan)是(shi)P188的聚(ju)環(huan)氧乙烯鏈和(he)聚(ju)環(huan)氧丙(bing)烷鏈的降(jiang)解(jie)是(shi)否(fou)會形成(cheng)不(bu)溶性顆(ke)粒(li)，目前(qian)仍(reng)不(bu)清(qing)楚。Wang T等人研究表明，P188在(zai)組氨酸(suan)緩沖體系中的(de)(de)(de)穩定性表現不(bu)如檸檬酸(suan)緩沖體系，金(jin)屬離子的(de)(de)(de)存在(zai)下，穩定型也(ye)變得比(bi)較差（圖(tu)6）。GC-MS鑒定的(de)(de)(de)物(wu)(wu)質包括P188的(de)(de)(de)典型自(zi)氧(yang)化(hua)產物(wu)(wu)乙(yi)(yi)酸(suan)、乙(yi)(yi)二醇(chun)(chun)(chun)及(ji)(ji)其(qi)低聚物(wu)(wu)和醇(chun)(chun)(chun)類、丙二醇(chun)(chun)(chun)及(ji)(ji)其(qi)低聚物(wu)(wu)和醇(chun)(chun)(chun)類以及(ji)(ji)各種乙(yi)(yi)二醇(chun)(chun)(chun)酯和丙二醇(chun)(chun)(chun)酯。此外，還觀察到一些PPO和PEO低聚物(wu)(wu)，這(zhe)些降解產物(wu)(wu)對不(bu)同蛋白(bai)質配方的(de)(de)(de)影響還需要進一步研究。
圖6：泊洛沙姆188在不同條件下的穩定(ding)性抗體(ti)類注射制劑(ji)(ji)(ji)中作為蛋(dan)白質穩定(ding)劑(ji)(ji)(ji)的(de)(de)表面(mian)活性(xing)劑(ji)(ji)(ji)除聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)20/80以及P188外，泊洛沙姆家族(zu)中的(de)(de)P407、PEG脂(zhi)肪酯(zhi)（如(ru)(ru)聚(ju)乙(yi)二醇(chun)(15)-羥基硬脂(zhi)酸酯(zhi)）、非酯(zhi)表面(mian)活性(xing)劑(ji)(ji)(ji)（如(ru)(ru)十二烷基葡糖苷和十二烷基麥芽(ya)糖苷）等均具有潛(qian)在(zai)的(de)(de)應用價(jia)值。當然，這(zhe)些(xie)潛(qian)在(zai)的(de)(de)替(ti)代(dai)物(wu)也(ye)有潛(qian)在(zai)的(de)(de)短板，比如(ru)(ru)酯(zhi)類表面(mian)活性(xing)劑(ji)(ji)(ji)可能存在(zai)與(yu)聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)相似包括酶(mei)解(jie)在(zai)內的(de)(de)問(wen)題，但也(ye)不能忽視它(ta)們(men)的(de)(de)可生物(wu)降解(jie)和生物(wu)相容(rong)性(xing)，這(zhe)些(xie)輔(fu)料的(de)(de)對產品包括安全性(xing)以及有效性(xing)的(de)(de)影(ying)響(xiang)還有待研究(jiu)者們(men)的(de)(de)進(jin)一(yi)步探究(jiu)。
